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2019 年 12 月，新型冠狀病毒 ( severe acute re- spiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2) 感染引起的新 型 冠 狀 病 毒 肺 炎 ( coronavirus disease 2019， COVID-19) 疫情暴發(fā)，并在全球范圍內(nèi)大流行。
雖然我國對 COVID-19 疫情的防控取得了階段性勝利，但全球疫情仍極為嚴峻。當前我國疫情防控的重點，已從對本土病例的防控轉(zhuǎn)變?yōu)閷惩廨斎胄圆±姆揽�，以及對�?jīng)冷鏈運輸進口物品攜帶污染及密切接觸人群的監(jiān)測。
各臨床醫(yī)療機構(gòu)和疾病預(yù)防控制部門的SARS-CoV-2 檢測工作已呈常態(tài)化，應(yīng)大力提升并具備 隨時應(yīng)對新一波疫情暴發(fā)、流行的能力�；谀壳芭R床檢測 SARS-CoV-2 所積累的經(jīng)驗和常見問題，并結(jié)合 最新研究進展，中國醫(yī)院協(xié)會臨床微生物實驗室專業(yè)委員會組織我國臨床微生物學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué) 檢驗相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜夜餐珜懥?《新型冠狀病毒實驗室 檢測專家共識》。
本共識明確了目前 SARS-CoV-2 臨床常用檢測方法的技術(shù)特點、注意事項、生物安全要求、 檢測和結(jié)果解讀的常見問題及應(yīng)對策略，以期在疫情防控常態(tài)化形勢下，為臨床實驗室正確、高效開展 SARS-CoV-2 檢測提供參考意見。
01.共識形成方法
本共識由中國醫(yī)院協(xié)會臨床微生物實驗室專業(yè)委員會發(fā)起，共識專家組由該委員會委員及其推薦的相 關(guān)領(lǐng)域?qū)＜夜餐M成，并通過共識形成會議法[1]達成共識意見。專家組擬訂關(guān)鍵問題和共識提綱后，以“新型冠狀病毒”“新型冠狀病毒肺炎”“severe acute respiratory syndrome coronavirus 2”“SARS-CoV-2”“coro- navirus disease 2019”和 “COVID-19”為關(guān)鍵詞，檢索 2019 年 12 月至 2020 年 11 月期間 PubMed、EMBase、 Cochrane Library、中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)、維普網(wǎng)數(shù)據(jù) 庫中關(guān)于 SARS-CoV-2 和 COVID-19 實驗室檢測相關(guān)的中、英文文獻，以及國家衛(wèi)生健康委員會和世界衛(wèi)生組織發(fā)布的 COVID-19 診療方案和技術(shù)標準，國內(nèi) 外學(xué)術(shù)組織現(xiàn)行的感染控制、生物安全相關(guān)標準、指 南和共識等。經(jīng) 3 輪遠程會議討論及反復(fù)修訂，形成共識草案，然后由所有專家對草案進行函審并提出書面意見，共收集函審意見 539 條 ( 含重復(fù)意見) ，全 部意見在第 4 次會議上逐條進行討論確認，并采納其中的 458 條，經(jīng) 23 次修訂最終形成本共識終稿。鑒 于目前對 SARS-CoV-2 的認知程度及共識參與人員的 專業(yè)背景，本共識的制定可能存在一定局限性。
02.新型冠狀病毒核酸檢測
2. 1 核酸檢測方法
國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的 《新型冠狀病毒肺炎診療方案 ( 試行第八版) 》[2]指出，對疑似病例采用實時熒光 PCR 法檢測 SARS-CoV-2 核酸為陽性或病毒基因測序結(jié)果與已知的 SARS-CoV-2 序列高度同源，即 可確診為 SARS-CoV-2 感染。核酸檢測陽性是發(fā)現(xiàn) SARS-CoV-2 攜帶者 ( SARS-CoV-2 核酸陽性但無明顯臨床和影像學(xué)表現(xiàn)，且血清特異性 SARS-CoV-2 抗體陰 性者) 和確診 SARS-CoV-2 感染的金標準。在 SARS-CoV-2 基因組序列確定的情況下[3-5]， 靶標可針對病毒基因組保守區(qū)域進行設(shè)計。
SARS- CoV-2 核酸檢測的靶基因主要包括: 開放讀碼框 1ab ( open reading frame 1ab，ORF1ab) 、核殼蛋白 ( nu- cleocapsid protein，N) 、包 膜 蛋 白 ( envelop protein， E) 和刺突糖蛋白編碼 ( spike glycoprotein，S) 基 因[6]。目前在中國獲批的試劑盒主要是針對其中的 一個或多個靶標進行檢測，建議同時檢測 2 個及以上 靶標，以保證結(jié)果的特異度和準確性。
目前國家藥品監(jiān)督管理局 ( National Medical Pro- ducts Administration，NMPA) 批準上市的 SARS-CoV-2 核酸檢測試劑盒所采用的檢測方法主要有實時熒光PCR 法、恒溫擴增法、聯(lián)合探針錨定聚合測序法、 雜交捕獲免疫熒光法、RNA 捕獲探針法、RNA 恒 溫擴增捕獲—金探針層析法、雙擴增法以及基于下 一代 測 序 技 術(shù) ( next-genera-tion sequencing，NGS ) 的 SARS-CoV-2 核酸檢測方法等。
2. 1. 1 實時熒光 PCR 法
目前醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室開展 SARS-CoV-2 核酸 檢測所采用的方法以實時熒光 PCR 法為主，其檢測下 限為 102 ～103 copies/mL，部分產(chǎn)品可達 10copies/mL。該方法檢測耗時存在差異，通常兩步法 ( 即核酸提取 與 PCR 擴增步驟獨立進行) 約需 3～ 3. 5 h ( 包括核酸 提取 0. 5～1. 5 h，PCR 擴增 1. 5～ 2 h) ，一步法 ( 即核 酸提取與 PCR 擴增一體化) 可縮短至 1 h 以內(nèi)。
2. 1. 2 恒溫擴增法
恒溫擴增法是在固定的溫度條件下進行擴增， 包含恒溫擴增實時熒光法和恒溫擴增芯片法。恒溫 擴增實時熒光法是將恒溫擴增技術(shù)和實時熒光檢測 技術(shù)相結(jié)合，可將 SARS-CoV-2 核酸檢測全流程時 間縮短至 1. 5 h 以內(nèi)。恒溫擴增芯片法是將恒溫擴 增技術(shù)與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，其特點是可在同一份樣本中同時檢測多種病原體。恒溫擴增法具有 集成能力強、自動化程度高、檢測時間短、檢測下 限低 ( 可達 102 copies/mL) 等特點。
2. 1. 3 其他 PCR 方法
聯(lián)合探針錨定聚合測序法、雜交捕獲免疫熒光法、RNA 捕獲探針法、RNA 恒溫擴增捕獲—金探針層析法、雙擴增法和巢式多重 PCR 法在 SARS-CoV-2 核酸檢測中亦發(fā)揮了重要作用。
在擴增多重病原靶標時，需同時檢測 1～ 2 種室內(nèi)質(zhì)控，以確保樣本處理、 核酸提取及 PCR 反應(yīng)的有效性。此外，也有研究使 用 PCR-核酸飛行時間質(zhì)譜進行 SARS-CoV-2 核酸檢 測[7]; 或應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)直接使用臨床樣本從多組學(xué) 角度檢測 SARS-CoV-2[8-10]。
SARS-CoV-2 核酸檢測的方法較多且各具特點， 即使同一種檢測方法，由于檢測試劑生產(chǎn)廠家或檢 測儀器不同，所需檢測時間及檢測下限均可能存在差異。因此，在實際工作中實驗室應(yīng)根據(jù)所使用的檢測試劑及設(shè)備說明書，制定相應(yīng)的標準操作規(guī) 程，開展 SARS-CoV-2 核酸檢測工作。
2. 1. 4 基于 NGS 的 SARS-CoV-2 核酸檢測
NGS 不依賴傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)，具有高通量、一次可檢測多個靶基因的特點，可發(fā)現(xiàn)新發(fā)病原 體、監(jiān)測病原體變異，為診斷試劑、疫苗、藥物等 研發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。在此次疫情初期，利用 NGS 從臨床樣本中成功鑒定出了 SARS-CoV-2 的基因組 序列[11]，為 SARS-CoV-2 的早期發(fā)現(xiàn)和診斷提供了 重要依據(jù)。疫情期間，NMPA 應(yīng)急批準 SARS-CoV-2 測序試劑盒可用于臨床樣本的常規(guī)檢測。但目前NGS 主要用于科研，其臨床大規(guī)模應(yīng)用需進一步標準化和規(guī)范化。
2. 2 核酸檢測注意事項與生物安全要求
SARS-CoV-2 核酸檢測主要包括樣本采集、轉(zhuǎn)運 和接收、核酸提取、PCR 擴增、報告解讀及醫(yī)療垃 圾處理等步驟。其注意事項及生物安全要求見表 1。
2. 3 核酸檢測結(jié)果解讀存在的問題與對策
2. 3. 1 核酸檢測與復(fù)檢以下情況建議復(fù)檢:
( 1) 樣本經(jīng) PCR 擴增后，目的基因 Ct 值大于試劑說明書閾值，但原始峰圖有信號;
( 2) 擴增結(jié)果為陽性，但原始峰圖并非典型 的 “S”形曲線;
( 3) 雙靶標試劑檢測結(jié)果不一 致;
( 4) 雙份試劑檢測結(jié)果不一致;
( 5) 檢測結(jié) 果與臨床癥狀、影像學(xué)表現(xiàn)不一致;
( 6) 若不同病 程階段核酸檢測結(jié)果發(fā)生變化，需連續(xù)多次采樣;
( 7) 大規(guī)模人群篩查流行率極低 ( <0. 1%) 時，出 現(xiàn)陽性結(jié)果，應(yīng)使用 1 ～ 2 種更靈敏且擴增區(qū)域不同 的試劑復(fù)檢[12]。
2. 3. 2 流行病學(xué)結(jié)合臨床分析原則
雖然核酸檢測是 SARS-CoV-2 病原學(xué)診斷的金標準，但仍存在一定的局限性。當臨床高度懷疑 SARS- CoV-2 感染而核酸檢測陰性時，需結(jié)合患者肺部 CT、 SARS-CoV-2 特異性抗體、血常規(guī)等其他檢測結(jié)果進 行綜合判斷。
2. 4 核酸檢測結(jié)果假陰性、假陽性分析
2. 4. 1 假陰性結(jié)果主要原因:
( 1) 感染的不同時期，病毒在人體不同部位載量存在差異;
( 2) 樣本 采集不規(guī)范;
( 3) 樣本轉(zhuǎn)運、保存或滅活方法不當， 導(dǎo)致 RNA 降解;
( 4) 病毒基因序列發(fā)生變異。
2. 4. 2 假陽性結(jié)果多由實驗室污染或操作不當造成。
2. 4. 3 避免假陰性或假陽性結(jié)果的應(yīng)對策略
( 1) 試劑質(zhì)量控制: 對不同的 SARS-CoV-2 核酸 檢測試劑性能進行比較，對試劑的性能參數(shù)進行驗 證，選取各種性能均較好的試劑。
( 2) 操作質(zhì)量控制: 核酸檢測的整個流程操作 復(fù)雜，不同產(chǎn)品的反應(yīng)體系及適用機型等存在差異， 實驗人員應(yīng)嚴格按照各自產(chǎn)品說明書要求進行操作。實驗室應(yīng)對樣本采集、轉(zhuǎn)運與保存、核酸提取、PCR 擴增、結(jié)果審核及報告進行全流程質(zhì)量控制。
( 3) 設(shè)置對照: 除每個檢測批次至少設(shè)置 3 份 陰性對照、1 份弱陽性對照 ( 第三方質(zhì)控品) [12]和內(nèi) 標控制孔外，應(yīng)設(shè)置空白對照以監(jiān)測實驗室污染。
( 4) 多指標診斷: 對核酸檢測結(jié)果為陰性但臨 床疑似感染患者，應(yīng)進行多部位樣本、多次采樣檢 測，并結(jié)合血清學(xué)結(jié)果、影 像 學(xué) 表 現(xiàn) 等 進 行 綜 合判斷。
03新型冠狀病毒免疫學(xué)檢測
N 蛋白和 S 蛋白是免疫檢測的主要抗原靶點。N蛋白位于病毒顆粒包膜內(nèi)核，與正義單鏈 RNA 纏繞并將其封裝成 RNA 核衣殼體; S 蛋白分布于病毒外殼，冷凍電鏡超微結(jié)構(gòu)為三聚體，其受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域receptor binding domain，RBD) 與人體細胞血管緊張 素轉(zhuǎn)換酶 2 受體結(jié)合后入侵人體細胞并導(dǎo)致感染[25]。
3. 1 新型冠狀病毒特異性抗體檢測
《新 型 冠 狀 病 毒 肺 炎 診 療 方 案 ( 試 行 第 七 版) 》[26]首次將 “血清 SARS-CoV-2 特異性抗體 IgM 和 IgG 陽性; 血清 SARS-CoV-2 特異性抗體 IgG 由陰 性轉(zhuǎn)為陽性或恢復(fù)期較急性期 4 倍及以上升高”作為疑似病例的確診標準之一。
《新型冠狀病毒肺炎診療方案 ( 試行第八版) 》[2]將 “SARS-CoV-2 特異性抗 體 IgM 陽性”作為疑似病例診斷依據(jù)之一，并指出 “SARS-CoV-2 特異性抗體 IgM 和 IgG 在發(fā)病 1 周內(nèi)陽 性率較低，一般不單獨以血清學(xué)檢測作為診斷依據(jù)， 需結(jié)合流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)和基礎(chǔ)疾病等情況進行綜合判斷”，強調(diào)動態(tài)觀察抗體水平變化。
因此，核酸檢測仍是判斷 SARS-CoV-2 感染的金標準[27]，抗體 檢測可用于核酸檢測陰性疑似病例的補充檢測，或在疑似病例診斷中與核酸檢測聯(lián)合應(yīng)用，但不能代替核 酸檢測單獨作為 SARS-CoV-2 感染者確診與否的依 據(jù)，亦不適用于一般人群的篩查。隨著 SARS-CoV-2 疫苗接種人群的逐漸擴大，詳細詢問患者疫苗接種史 及免疫相關(guān)基礎(chǔ)疾病，對理解其抗體水平變化趨勢及 抗體檢測結(jié)果至關(guān)重要。
3. 1. 1 抗體檢測方法
SARS-CoV-2 抗體檢測試劑多以 N 蛋白和 S 蛋白作為捕獲抗原，主要檢測 IgM、IgG。一般情況下，機體感染病毒后抗體水平變化如圖 1。
IgM 產(chǎn)生最早 ( SARS-CoV-2 特異性抗體 IgM 多在發(fā)病 3～ 5 d 后開始 出現(xiàn)陽性[2，28]) ，但濃度及親和力較低、維持時間 短，是急性期感染的診斷指標; IgG 產(chǎn)生較晚 ( 一般 在出現(xiàn)癥狀一周后[28-29]) ，但濃度及親和力高、維持 時間較長 ( 有研究顯示 SARS-CoV-2 特異性抗體 IgG 維持時間約為 3～ 6 個月) ，是感染中后期或既往感染的診斷指標[30]。
機體感染 SARS-CoV-2 產(chǎn)生抗體的時 間和規(guī)律仍需更多的科學(xué)研究加以證實。NMPA 已批準的 SARS-CoV-2 抗體檢測方法主要有 化學(xué)發(fā)光法、膠體金法和熒光免疫層析法�；瘜W(xué)發(fā)光 法具有線性范圍寬、通量高、自動化程度高、操作易 于標準化等特點，但依賴于特定的化學(xué)發(fā)光檢測儀， 成本較高，臨床普及受限。
膠體金法和熒光免疫層析 法操作簡便、快捷，突破了現(xiàn)有檢測技術(shù)對人員、場 所的限制，可在 15 min 內(nèi)獲得結(jié)果，適用于基層醫(yī)療 單位及現(xiàn)場篩查，但靈敏度受限[31]。上述方法均為定 性檢測，目前尚無可用于定量分析的試劑盒。
3. 1. 2 抗體檢測注意事項與生物安全要求
SARS-CoV-2 抗體檢測的注意事項及生物安全要求見表 2。
3. 1. 3 抗體檢測結(jié)果解讀中的問題與對策
3. 1. 3. 1 抗體檢測與復(fù)檢
( 1) 在低流行風險人群中，若抗體檢測結(jié)果呈 弱陽性或陽性，建議結(jié)合核酸檢測等結(jié)果進行解讀， 亦可采用另一種高特異度的方法或試劑盒進行復(fù)檢;
( 2) 如抗體檢測結(jié)果呈陰性，但臨床懷疑為 SARS-CoV-2 感染，建議進行核酸檢測，并采用另一 種高靈敏度的方法或試劑盒進行復(fù)檢;
( 3) 如考慮存在干擾因素，可通過樣本滅活、 使用類風濕因子吸附劑處理等方式處理后，進行 復(fù)檢。
3. 1. 3. 2 不同檢測方法間性能存在差異的原因
( 1) 原理不同: 雙抗原夾心法、捕獲法、間接法等不同檢測方法的靈敏度不同。
( 2) 捕獲抗原不同: ①抗原種類或選擇的片段 不同: N 蛋白的免疫原性和特異度均高于 S 蛋白，但靈敏度低[37]，不同試劑盒可能單獨采用 S 蛋白、N蛋白或 S+N 蛋白抗原組合、全長或僅 RBD 為捕獲抗 原; ②S ∶ N 抗原比不同; ③體外重組蛋白表達系統(tǒng)不同，真核表達系統(tǒng)表達的蛋白具有一定程度的折疊加工和糖基化修飾，性質(zhì)較原核表達系統(tǒng)表達的蛋白更穩(wěn)定，特異度更高。
( 3) 待檢抗體種類不同: 如單獨檢測 ( IgM 或 IgG) 、雙重檢測 ( IgM +IgG) 或總抗體檢測 ( IgM + IgG+IgA) ，聯(lián)合檢測可提高檢出率。
3. 1. 3. 3 抗體檢測結(jié)果假陰性、假陽性分析
假陰性檢測結(jié)果的可能原因:
( 1) 抗體表達存 在窗口期;
( 2) 檢測試劑盒靈敏度受限;
( 3) 樣本 保存或?qū)嶒灢僮鞑划?
( 4) 輕癥患者抗體反應(yīng)較 弱[38];
( 5) 樣本滅活導(dǎo)致低水平抗體降解。
假陽性檢測結(jié)果的可能原因:
( 1) 不同種屬冠狀病毒的 N 蛋白或 S 蛋白存在免疫交叉反應(yīng)[39];
( 2) 患 者自身存在高濃度類風濕因子、抗核抗體等免疫學(xué)干 擾因素[40-41];
( 3) 實驗室或試劑盒污染;
( 4) 樣本 檢測前的滅活可能導(dǎo)致熒光免疫層析法檢測假陽 性[42];
( 5) 陽性判斷值的設(shè)定: 陽性判斷值附近的 弱陽性，有一部分可能為假陽性，因此弱陽性患者建議 3～ 5 d 后復(fù)查;
( 6) 樣本溶血、血液樣本凝固不 全或患者出現(xiàn)黃疸等，可能會導(dǎo)致假陽性結(jié)果，但目前缺乏實驗證據(jù)，需進一步研究驗證。
3. 2 新型冠狀病毒核酸和特異性抗體聯(lián)合檢測結(jié)果解讀
核酸檢測結(jié)果是判斷患者有無 SARS-CoV-2 感染的 直 接 證 據(jù)，抗 體 檢 測 結(jié) 果 可 作 為 輔 助 判 斷 SARS-CoV-2 感染的間接證據(jù)以及評估疫苗效果， 核酸檢 測 與 抗 體 檢 測 各 有 優(yōu) 劣，不 能 互 相 替 代。
單獨采用抗體檢測時，其結(jié)果解讀需謹慎，尤其 應(yīng)核對患者流行病學(xué)史、是否接種 SARS-CoV-2 疫 苗及 是 否 合 并 免 疫 相 關(guān) 基 礎(chǔ) 疾 病。人 體 感 染SARS-CoV-2 后核酸載量、抗體水平呈現(xiàn)不同的變 化 ( 圖 1) ，在不同病程階段，核酸和抗體檢測的 靈敏度不同，特別是在感染中后期，核酸檢出率降低，抗體檢出率升高，核酸與抗體聯(lián)合檢測可降低漏診率，提高檢出率，對臨床診斷具有重要 意義。
針對實驗室 SARS-CoV-2 核酸及抗體聯(lián)合檢 測結(jié)果的解讀見表 3。
3. 3 新型冠狀病毒抗原檢測
抗原檢測是指應(yīng)用 SARS-CoV-2 特異性抗體直接 檢測樣本中的病原體，其結(jié)果可作為早期確認該病原 體感染與否的直接證據(jù)，且具有操作簡便、報告時間 短等優(yōu)勢。所檢測抗原主要是 N 蛋白和 S 蛋白，N 蛋 白在 β 屬冠狀病毒之間相對保守、合成數(shù)量多，具 有很強的抗原性，其抗原決定簇是特異性抗體結(jié)合的主要位點。
抗原檢測適用的樣本類型一般為感染部位 樣本，主要為鼻咽拭子和肺泡灌洗液等。檢測結(jié)果受 樣本質(zhì)量、感染部位及病毒表達量等因素影響較大， 靈敏度低、易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。如何提高抗原檢測的 靈敏度是影響該檢測方法在臨床上應(yīng)用的關(guān)鍵問題， 需進一步篩選制備高親和力和高特異度的抗體，以用 于抗原檢測試劑的開發(fā)。
目前，國內(nèi)外許多企業(yè)致力于 SARS-CoV-2 抗原 檢測試劑盒的研發(fā)，已有試劑盒獲得食品藥品監(jiān)督管 理局緊急使用授權(quán)并批準上市，NMPA 亦應(yīng)急審批通 過 2 款 SARS-CoV-2 抗原檢測試劑盒上市。
04.新型冠狀病毒培養(yǎng)
細胞培養(yǎng)分離病毒是病原學(xué)鑒定的金標準，所獲 毒株是檢測試劑和疫苗開發(fā)、抗病毒藥物篩選等研究的重要基礎(chǔ)。SARS-CoV-2 的培養(yǎng)必須在具備生物安 全三級 ( BSL-3) 及以上資質(zhì)的實驗室內(nèi)進行，不得 在臨床常規(guī)生物安全二級 ( BSL-2) 實驗室中進行， 因此不推薦新型冠狀病毒培養(yǎng)作為常規(guī)診斷方法。
鼻咽拭子、痰及其他下呼吸道分泌物等臨床樣本均可通過接種人呼吸道上皮細胞、Vero-E6 和 Huh-7 細胞系等進行分離培養(yǎng)。選取經(jīng)熒光定量 PCR 和/或 NGS 方 法檢測出核酸陽性且 Ct 值較低 ( 即病毒載量較高) 的樣本進行分離培養(yǎng)，應(yīng)考慮取材部位、取材時間及 樣本送檢與保存等因素的影響。
05.總結(jié)
SARS-CoV-2 是一種新發(fā)病原體，目前對該病毒的致病性、檢測方法性能的了解仍有限，需開展更多的基礎(chǔ)和臨床研究，以提高其檢測方法效能、提升臨 床及實驗室診斷能力。本共識基于現(xiàn)有研究結(jié)果和相關(guān)指南，對 SARS-CoV-2 實驗室檢測相關(guān)問題進行了 分析，并提出了應(yīng)對策略，以供臨床實驗室參考和應(yīng) 用。
在 SARS-CoV-2 檢測過程中，臨床實驗室應(yīng)積極與臨床溝通，結(jié)合患者流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)、影像 學(xué)改變及其他檢測結(jié)果綜合分析。對于未來可能發(fā)生甚至目前已經(jīng)發(fā)生的病毒生物學(xué)變異所帶來的檢測挑 戰(zhàn)，仍有諸多未知因素有待進一步探索和研究。
參考資料：中國醫(yī)院協(xié)會臨床微生物實驗室專業(yè)委員會，《新型冠狀病毒實驗室檢測專家共識》
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