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摘 要：目的 對明德生物QMT8000免疫定量分析儀檢測降鈣素原(PCT)的主要方法學(xué)性能進(jìn)行驗(yàn)證與評價。方法 參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)系列文件，結(jié)合實(shí)際工作設(shè)計驗(yàn)證方案，對免疫定量分析儀檢測全血PCT 的精密度、線性、可比性、抗干擾能力等4項(xiàng)分析性能進(jìn)行驗(yàn)證和評價。結(jié)果 該定量方法操作簡便、快速，整個檢測過程約17min;PCT 定量時，批內(nèi)、批間精密度為1.26%～3.96%;檢測線性良好，相關(guān)系數(shù)r大于0.99，回歸方程檢驗(yàn)有意義(P<0.05)，與廠商宣稱范圍接近;該定量法與半定量法檢測結(jié)果一致性達(dá)92%;三酰甘油、膽紅素對檢測結(jié)果無明顯影響，溶血可使檢測結(jié)果顯著偏高(P<0.05)。結(jié)論 該科室引進(jìn)的降鈣素原免疫定量分析儀操作簡便、主要性能評價良好，可滿足臨床指導(dǎo)抗菌藥物的應(yīng)用等需要。
降鈣素原(PCT)即降鈣素前體，是一種無激素活性的糖蛋白。生理情況下，甲狀腺C細(xì)胞可產(chǎn)生極少量的PCT，健康人的血液PCT水平通常測不到，血液濃度小于0.5μg/L;細(xì)菌感染時，除甲狀腺外，肝臟的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，肺、腸道組織的淋巴細(xì)胞及內(nèi)分泌細(xì)胞都能合成分泌PCT，此時血清PCT 水平會明顯升高，且隨著感染進(jìn)展或控制而持續(xù)升高或逐漸下降。Dandona等認(rèn)為細(xì)菌內(nèi)毒素是誘導(dǎo)PCT 產(chǎn)生的最主要刺激因子，健康人注射少量的細(xì)菌內(nèi)毒素就能刺激PCT的合成。早在2001年國際膿毒癥會議，PCT已被定為膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)之一，現(xiàn)在PCT水平已作為一個新的炎癥指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于感染性疾病的診斷、鑒別診斷、病情監(jiān)測及抗菌藥物應(yīng)用指導(dǎo)等。降鈣素原的檢測方法有半定量法和定量法。半定量法通常利用膠體金免疫層析技術(shù)，定量法以往多為化學(xué)發(fā)光法。本科室新引進(jìn)的一臺免疫定量分析儀，是以免疫層析為基礎(chǔ)而研發(fā)的定量檢測方法，第一步采用固相免疫膠體金層析技術(shù)，利用雙抗體夾心法檢測人全血中的PCT，出現(xiàn)質(zhì)控線和檢測線，第二步采用圖像分析處理技術(shù)，通過采集PCT檢測試劑卡中質(zhì)控線和檢測線的圖像，獲得濃度信號，分析軟件自動將濃度密度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較分析，即可得出被測樣本中PCT的定量結(jié)果。 現(xiàn)就其主要檢測性能作出評價。
1 材料和方法
1.1 檢測樣本 本院門/急診及住院患者經(jīng)乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝的靜脈血樣本50份，其中PCT 高值血樣來自細(xì)菌培養(yǎng)陽性的患者。三酰甘油含量為6.02 mmol/L 的乳糜樣本;總膽紅素含量為184.2μmol/L 的黃疸樣本。
1.2 儀器與試劑 降鈣素原免疫定量分析儀、降鈣素原檢測試劑盒均由武漢明德生物科技股份有限公司生產(chǎn)。
1.3 方法
1.3.1 精密度試驗(yàn) 選擇PCT 高值34μg/L、低值0.23μg/L的臨床樣本各一份，同時檢測20次作批內(nèi)精密度測試;以質(zhì)控卡(22～26μg/L)為檢測對象，每天隨臨床標(biāo)本同時檢測，連續(xù)20天作批間精密度測試，同時做質(zhì)量控制分析。
1.3.2 線性 按參考文獻(xiàn)和CLSL 的EP6-A2 文件方法，本試驗(yàn)以稀釋液空白代替低濃度(L)，以PCT 濃度值為34μg/L的患者樣本作為高濃度(H)，按20L、19L+1H、18L+2H、16L+4H、12L+8H、8L+12H、4L+16H、2L+18H、20H 的關(guān)系配制，形成系列濃度全血。每個標(biāo)本重復(fù)測量2次，記錄結(jié)果。將實(shí)測值與理論值作比較，作直線回歸方程。
1.3.3 可比性 本研究共收集了50 例標(biāo)本，先進(jìn)行半定量PCT 測定，隨后用定量分析儀檢測PCT 的具體含量，比較二者檢測結(jié)果的一致性。將分離后的血清200μL 或400μL 加到反應(yīng)孔中，觀察反應(yīng)區(qū)的顏色變化。在出現(xiàn)紅色對照帶的前提下，如加入的總血清量為200μL，比照200μL 的比色卡讀出PCT 的大致范圍(結(jié)果分為小于0.5μg/L，≥0.5μg/L，≥2μg/L，≥10μg/L);如加入的總血清量為400μL，比照400μL的比色卡讀出PCT 的大概范圍(結(jié)果分為小于25μg/L，≥0.25μg/L，≥1μg/L，≥5μg/L)。
1.3.4 干擾試驗(yàn) 按參考文獻(xiàn)和CLSL 的EP6-A2文件方法，分別將乳糜樣本、黃疸樣本按20L、19L+1H、18L+2H、16L+4H、12L+8H、8L+12H、4L+16H、2L+18H、20H 的關(guān)系用生理鹽水配制，形成系列濃度血樣，然后將系列濃度的干擾物與待測全血等量混合，在免疫定量分析儀上檢測2次，取均值。根據(jù)文獻(xiàn)計算影響度。影響度=[(加入干擾物血樣測定值- 未加入干擾物血樣測定值)/未加入干擾物血樣測定值]×100%。取同日被檢的10份臨床標(biāo)本，原PCT 檢測值為A 組;用帶有針頭的一次性注射器，反復(fù)抽打上述10份標(biāo)本至肉眼可判斷為溶血，再次檢測得出的B組結(jié)果，比較其與A 組值之間的統(tǒng)計學(xué)差異。
1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行配對t檢驗(yàn)與回歸方程分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 精密度驗(yàn)證 樣品檢測20次，批內(nèi)、批間精密度試驗(yàn)結(jié)果見表1，基本符合NCCLSEP5-A2文件推薦的小于5%的標(biāo)準(zhǔn)。
(表1)2.2 線性評價和檢測限 PCT 系列濃度標(biāo)本測定結(jié)果見表2，以理論值為x，實(shí)測均值為Y，建立Y=a+bX的回歸方程，PCT 回歸方程為Y=0.533+0.969X，r=0.998，決定系數(shù)r2為0.996。F顯著性檢驗(yàn)：F=1510.4，P<0.05，回歸方程有意義。同時，由表2可看出，免疫定量分析儀的檢測下限為0.1μg/L，與廠商提供的一致。
(表2)2.3 比對試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)制定不同半定量范圍內(nèi)的PCT與定量PCT 檢測結(jié)果是否一致的判斷標(biāo)準(zhǔn)。由表3可以看出，兩種方法檢測結(jié)果一致率達(dá)92%，僅8% 的標(biāo)本檢測結(jié)果有偏差。
(表3)2.4 干擾試驗(yàn) 將系列濃度的乳糜和黃疸干擾物與待測全血等量混合，測定值及影響度見表4、5。將10份標(biāo)本溶血處理前后得到的結(jié)果做配對t檢驗(yàn)，t=-3.554，P<0.05，說明溶血后檢測結(jié)果顯著升高。
(表4)
(表5)3 討論P(yáng)CT 作為細(xì)菌性感染最特異的指標(biāo)之一，臨床應(yīng)用越來越廣泛，如膿毒癥的診斷與監(jiān)測：血液中PCT 濃度小于表示膿毒癥的可能性低、>2μg/L 表示極可能為膿毒癥，發(fā)展至重癥膿毒癥和/或膿毒癥性休克的風(fēng)險較高、在0.5～2.0μg/L 之間時，需結(jié)合患者的病史來判定結(jié)果;細(xì)菌性與非細(xì)菌性感染的鑒別診斷：血液PCT 升高多由于細(xì)菌性感染，而PCT 無明顯升高則可能是其他原因?qū)е碌母腥�，包括�?chuàng)傷、外科手術(shù)、重癥胰腺炎、腫瘤浸潤等;臨床抗菌藥物應(yīng)用的指導(dǎo)：PCT 濃度<0.1μg/L，不建議使用抗菌藥物;在0.1～0.25μg/L 之間，不鼓勵使用抗菌藥物;在0.25～0.50μg/L之間，建議使用抗菌藥物;>0.5μg/L 時，強(qiáng)烈建議使用抗菌藥物等。本科室新引進(jìn)一臺降鈣素原免疫定量分析儀，其檢測參數(shù)的準(zhǔn)確性直接影響臨床診斷及治療，因此需要對其主要分析性能進(jìn)行驗(yàn)證與評價。選取兩份臨床標(biāo)本，分別在高、低兩個水平驗(yàn)證免疫定量分析儀檢測全血PCT 的精密度。結(jié)果表明，該儀器的檢測精密度為1.26%～3.96%。在儀器說明書顯示的范圍內(nèi)，也達(dá)到了國際公認(rèn)的質(zhì)量要求。每日的質(zhì)控卡檢測結(jié)果均在正常范圍內(nèi)，說明儀器在控，檢測結(jié)果均可信。選擇1份線性高值的樣品配成系列濃度水平用理論值與實(shí)測值作回歸分析得出PCT的回歸方程Y=0.533+0.969X(X為理論值)，r=0.998，決定系數(shù)r2為0.996。表明線性良好，與儀器說明書上的結(jié)果基本一致，也達(dá)到公認(rèn)的質(zhì)量要求。為驗(yàn)證免疫定量分析儀的可靠性，本研究比較了2種不同方法的檢測結(jié)果，由于一種是定量檢測，一種是半定量檢測，檢測結(jié)果不能進(jìn)行相關(guān)性分析，若按照半定量PCT 檢測方法中小于0.25μg/L 作為陰性值的判斷標(biāo)準(zhǔn)，則從檢測結(jié)果陰陽性的角度考慮，其中46 例二者的檢測結(jié)果一致，一致率高達(dá)92%，說明免疫定量分析儀檢測結(jié)果較為可靠。干擾試驗(yàn)表明，加入三酰甘油、膽紅素前后，檢測結(jié)果無明顯變化，影響度均小于5%，說明三酰甘油、膽紅素不引起干擾效應(yīng)，該方法檢測特異性較好。另外，對標(biāo)本進(jìn)行人為溶血處理后，檢測結(jié)果表明10份標(biāo)本PCT 水平均明顯升高。Schuetz等已證實(shí)，內(nèi)毒素和炎癥介質(zhì)刺激后，外周血單核細(xì)胞(PBMC)中ProCT mRNA 上調(diào)近一倍，各白細(xì)胞亞群亦表現(xiàn)出不同程度ProCT 蛋白增加。因此，當(dāng)單核細(xì)胞破碎后，細(xì)胞內(nèi)的PCT 釋放，可造成全血PCT 水平的升高。降鈣素原免疫定量分析儀為融合了膠體金免疫層析技術(shù)的定量檢測方法，既避免半定量法主觀判斷帶來的人為誤差，又較化學(xué)發(fā)光法定量法操作簡便，且用血量較少，使檢測過程更為客觀、科學(xué)、方便。其次，使用EDTA-K2抗凝的全血代替血清，可與急性時相反應(yīng)蛋白(CRP)一起作為血常規(guī)檢查的附加項(xiàng)目，縮短了檢測周期，可使患者及時得到檢驗(yàn)結(jié)果，方便臨床醫(yī)生參考、確定抗菌藥物治療方案，既能及時控制炎癥，又能避免抗菌藥物的濫用。
綜上，本文對免疫定量分析儀檢測PCT 的主要分析性能進(jìn)行驗(yàn)證，其結(jié)果與廠商承諾的性能指標(biāo)基本一致，也與公認(rèn)的質(zhì)量指標(biāo)基本一致;且它是一款具有操作簡便、精密度高、線性好、檢測范圍廣、結(jié)果重復(fù)性好、抗干擾能力強(qiáng)、檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)的定量檢測儀，可在實(shí)際工作中應(yīng)用并推廣。然而，該方法仍存在一定的不足，如溶血樣本對檢測結(jié)果有干擾，應(yīng)避免使用溶血樣本;某些含有抗試劑盒中某種成分的抗體的樣品可能會影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性;可能存在假陽性、假陰性結(jié)果等。因此檢驗(yàn)結(jié)果仍需臨床醫(yī)生結(jié)合患者的病史及所進(jìn)行的所有其他化驗(yàn)結(jié)果來判定，臨床確診應(yīng)由專業(yè)人員結(jié)合患者臨床癥狀、體征以及輔助檢查等其他診斷依據(jù)進(jìn)行綜合判斷。
參考文獻(xiàn)(略)陳 燕，李文靜 ，石冬敏南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州市立醫(yī)院本部檢驗(yàn)科，江蘇蘇州215002
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